导读甲基化测序分析答===============建立索引===========================bismark_genome_preparation --bowtie2 / --verbose  index/================比对=============================bismark --bowtie2 -N 0 -L 20 --quiet --un -...

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甲基化测序分析

甲基化测序分析

答===============建立索引===========================

bismark_genome_preparation --bowtie2 / --verbose  index/

================比对=============================

bismark --bowtie2 -N 0 -L 20 --quiet --un --ambiguous --sam --nucleotide_coverage --genome index/ --samtools_path /gpfs03/home/jingjing/software/samtools-1.9/ -o SRR10401142 -1 /fastq/SRR10401142.1_1.fastq.gz -2 /fastq/SRR10401142.1_2.fastq.gz

================去重===============================

deduplicate_bismark --samtools_path /gpfs03/home/jingjing/software/samtools-1.9/ -p SRR10401142.1_1_bismark_bt2_pe.sam --output_dir dedup

=====================提取甲基化信息==================

bismark_methylation_extractor -p --comprehensive --no_overlap --bedGraph --counts --buffer_size 200G --report --cytosine_report --samtools_path /gpfs03/home/jingjing/software/samtools-1.9/ --genome_folder index/ dedup/SRR10401142.1_1_bismark_bt2_pe.deduplicated.bam -o SRR10401142/

生成处理报告：

bismark2report

它包括了比对信息，甲基化信息，M-bias等，可以对数据有一个大概的认知。

结果合并正反链的数据后会输出CpG/CHG/CHH三种类型的甲基化文件，包含了胞嘧啶所有的组合形式，但实际上我们自然最关注的是CpG位点的甲基化。其中

CpG_context_SRR10401142.1_1_bismark_bt2_pe.deduplicated.txt即CpG甲基化位点的文件。

# 第一列为测序信息

# 第二列为甲基化状态 + 代表甲基化 -代表未甲基化

# 第三列代表chromosome

# 第四列代表location

# 第五列代表methylation call，简单来说大写的就是甲基化的（因为还有CHG，CHH的数据，分别对应x, X , h, H）

SRR10401142.1_1_bismark_bt2_pe.deduplicated.bismark.cov.gz文件则给了每个位点的甲基化比例，为下一步确定CpG岛提供了基础，其数据形式如下：

其中：# 第一列代表chromosome  # 第二，三列代表location  # 第四列代表甲基化百分比

# 第五列代表甲基化数目  # 第六列代表未甲基化数目

蛋白质甲基化检测常用方法？

答蛋白质甲基化检测是研究蛋白质表观遗传修饰的一种重要方法之一。以下是常用的蛋白质甲基化检测方法：

1、免疫印迹（Western blotting）：使用特异性抗体结合甲基化蛋白质，在蛋白质电泳分离后进行检测。可以通过对不同样品的比较来定量甲基化水平。

2、免疫组织化学（IHC）：在组织切片上使用特异性抗体标记甲基化蛋白质，通过显色反应来可视化甲基化的位置和强度。

3、免疫共沉淀（Co-IP）：利用特异性抗体将甲基化蛋白质与其互作的蛋白质一起结合，然后使用Western blotting等方法检测共沉淀的蛋白质。

4、质谱法（MS）：通过质谱分析技术对蛋白质进行定性和定量检测。可以通过氨基酸残基的质量变化来判断是否发生了甲基化修饰。

5、甲基化特异性PCR（MSP）：利用特异性引物扩增甲基化或非甲基化的DNA序列，结合凝胶电泳分析来判断目标基因是否发生了甲基化。

蛋白质甲基化

这些方法可以单独或联合使用，根据实验目的和样品类型的不同选择合适的方法进行蛋白质甲基化检测。

如何进行DNA甲基化分析

答基因甲基化的检测方法主要有以下几种：

甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

2、亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。

3、甲基化敏感扩增多态性

(Methylation-Sensitive Amplified Polymorphism,MSAP)

MSAP是利用对DNA甲基化敏感的两种同裂酶Hpa II和Msp I来对基因组DNA进行酶切和连接。由于两种酶能够识别相同的限制性酶切位点，即CCGG位点。当DNA序列中的CCGG位点出现不同程度的甲基化状态时，会分别被这两种酶识别，以有无产物的方式体现出来。

4、焦磷酸测序(Pyrosequencing)

通过准确定量单个连续的CpG 位点上的甲基化频率，焦磷酸测序能检测并定量甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。

差异甲基化分析R包methylkit、DSS和dmrseq的比较

答首先，对3个R包进行简单介绍。

methylkit：用于高通量亚硫酸氢盐测序的DNA甲基化分析和注释的R包。该包的目的是处理RRBS以及WGBS的测序数据。此外，也可以处理从Tab-seq或oxBS-seq获得的5hmC的碱基对分辨率数据。

DSS：该软件包专为高通量测序数据的差异分析而设计，依赖于bsseq包。它提供了用于分析RNA-seq 差异表达和亚硫酸氢盐测序 (BS-seq) 差异甲基化的功能。DSS 的核心是一个基于分层贝叶斯模型的程序，用于估计和缩小基因或 CpG 位点特异性分散，然后进行 Wald 检验以检测差异表达/甲基化。

dmrseq：这个包建立在bsseq包的基础上，bsseq包提供了亚硫酸氢盐测序数据的有效存储和操作以及对差异甲基化cpg的推断。dmrseq的主要目的是检测差异甲基化区域或CpGs。

methylkit没有生物学重复时使用fisher精确回归，有生物学重复时使用逻辑回归。

methylkit的可视化比较丰富且好看，其他两个的可视化不多还不好看。

3款R包的差异甲基化区域的筛选结果都可用于后续注释，注释一般用chipseerker包或者genomation包。methylkit注释用的是genomation包。

比较推荐chipseerker包，注释结果的输出和可视化都很好，但是无法对cpg岛进行注释。genomation包可注释cpg岛。

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